河上　裕　　（かわかみ　ゆたか）

1　ヒト腫瘍抗原の同定と免疫応答の解析

我々は、各種癌種におけるヒト腫瘍抗原を、癌患者血清を用いたcDNAクローニング法(SEREX)やDNAチップを用いた網羅的遺伝子発現解析など、様々な免疫学的・分子生物学的手法を駆使して単離同定した。シグナル分子の網羅的塩基配列決定により同定された悪性黒色腫で高頻度に共通変異の認められるBRAFや、DNAチップを用いた網羅的遺伝子発現解析により同定された悪性黒色腫に高頻度に発現するFABP7、RDA法で単離され、各種癌で発現する癌精巣抗原CRT2など様々なヒト腫瘍抗原を同定した（特許出願）（表1）。抗原によっては、患者において免疫原性をもつだけでなく、RNA干渉により癌細胞の増殖・浸潤を阻害したことから、抗原消失が起こり難い免疫療法の標的として、また、分子標的治療の標的になり得ることを見いだした。また、同定抗原を用いた癌患者免疫応答の解析により、ヒトにおける抗腫瘍免疫応答を検討し、癌細胞の遺伝子異常、特に癌の悪性形質に関与する異常遺伝子に由来する癌特異的アミノ酸変異ペプチド抗原は癌の免疫学的拒絶に有用であること、それらはしばしば個々の症例に特有な固有抗原であることを明らかにした。また、共通抗原であっても、個々の症例での癌細胞発現量やHLAタイプも含めた症例の免疫応答能に規定されて、症例毎に免疫原性は異なることを見いだした。すなわち免疫療法においても、個別化療法の開発が重要であることを示した。

2　担癌生体免疫抑制環境構築の分子機構の解明と克服法の開発

担癌患者では、癌細胞が産生する様々な分子がトリガーとなり、癌細胞自体が産生する免疫抑制分子に加えて、制御性T細胞や骨髄由来抑制性細胞や制御性樹状細胞などの各種免疫抑制性細胞のカスケード的誘導により、免疫抑制環境が構築される。免疫抑制環境の分子機構の解明とその克服法の開発は免疫療法の改良のためには重要である。レンチウイルスRNA干渉法を用いて、悪性黒色腫、大腸癌などでは、活性型BRAF(V600E)共通変異やRAS変異などによるMAPKシグナルの恒常的亢進により、癌細胞の増殖・浸潤亢進や、さらに、IL-10, VEGF, IL-6などの多様な免疫抑制性因子産生を介して、樹状細胞成熟化の阻害、制御性樹状細胞誘導などの免疫抑制にも関与することを明らかにした（図1）。同様に、癌細胞におけるSTAT3やWntシグナルの恒常的活性化も免疫抑制性サイトカインの産生に関わることも明らかにした。これらの結果は、シグナル阻害剤などの分子標的治療薬やRNA干渉を用いた担癌生体免疫抑制環境解除の可能性を示唆し、今後、マウス腫瘍モデルを用いて個体レベルでの免疫抑制機構の克服を確認し、臨床試験の可能性を追究する予定である。

3　マウス腫瘍モデルでの樹状細胞腫瘍内投与による個別化免疫療法の開発

個別化免疫療法として、個々の症例の腫瘍内に免疫増強操作を行う方法があるが、我々は、マウス腫瘍モデルを用いて、体外培養した樹状細胞を腫瘍内投与する方法の開発を試みた。樹状細胞単独投与では、抗腫瘍効果は弱いので、2つの改良行った。一つは、腫瘍の凍結融解前処置を行うことにより、腫瘍組織はネクローシスを主体とした細胞死を起こし、凍結融解した癌細胞成分が樹状細胞に効率よく取り込まれ、所属リンパ節に移動することを明らかにした。また、癌細胞からの腫瘍抗原ペプチドを結合した癌細胞由来hspは、樹状細胞へ抗原を供給するだけでなく、その活性化も期待できる。もう一つ改良は、樹状細胞をBCG-CWS などのTLR刺激分子で短時間培養することにより、貪食機能を保ったまま、時間とともに成熟活性化させる条件を決定し、投与後の樹状細胞の成熟化を促進させた。また、強いヘルパーCD4+T細胞を誘導できる外来抗原であるKLH(Keyhole limpet hemocyanin)で樹状細胞を感作することにより、CD40Lを発現する活性化T細胞を介した生体内での樹状細胞の成熟化も試みた。凍結融解腫瘍前処置とTLR刺激分子およびKLHの併用により、樹状細胞単独の腫瘍内投与に比較して、抗原スプレッデイング機構を介した内在性の腫瘍抗原に対する免疫誘導の惹起により、強い全身性の抗腫瘍T細胞を誘導が可能となり、マウス腫瘍モデルでは約1cm径の対側未処置腫瘍をも退縮させることが可能になった。さらに、免疫抑制性の制御性T細胞の阻害法の併用により、抗腫瘍効果をより増強することにも成功した。

4　樹状細胞腫瘍内投与による免疫療法の臨床試験

マウス腫瘍モデルの結果に基づき、文部科学省21世紀型革新的ライフサイエンス技術開発プロジェクトTRプログラムおよびがんTRプログラムの外部資金を得て、本学、外科・皮膚科と共同で、樹状細胞腫瘍内投与による免疫療法（特許出願）の臨床試験を開始した（図2）。まず、臨床用樹状細胞の体外培養法として、GMP規格の抗CD14抗体MACSビーズとCliniMACS装置を用いて分離した単球からバック中で樹状細胞を調整する半閉鎖系培養法を確立した。最初に、進行消化器癌に対して、本法で調整した樹状細胞にKLHを感作させて単独で腫瘍内投与する臨床試験を施行した。頻回に化学療法を受けた進行癌症例からの樹状細胞の調整では、樹状細胞の回収率や成熟能が低下する場合があることが明らかになった。免疫抑制環境にある腫瘍組織内への投与では、樹状細胞が十分に全身性の免疫誘導を起こせない可能性が考えられたが、本臨床試験では、樹状細胞に感作したKLHとウィルス抗原ペプチドに対する全身性の免疫応答の上昇が、DTH皮内反応とHLAマルチマー法で確認され、進行癌に対する樹状細胞腫瘍内投与による免疫誘導がヒトでも可能なことが判明した。本臨床試験では、重篤な副作用は認められなかったが、抗腫瘍効果は1例で小転移巣の消失が認められただけであった。次に、マウス腫瘍モデルで、より強力な抗腫瘍効果を示した改良型プロトコールの臨床試験として、悪性黒色腫皮下腫瘤および原発性肺癌に対して、腫瘍凍結融解前処置後のBCG-CWS感作樹状細胞の腫瘍内投与、また、消化器癌肝転移に対して凍結融解前処置後のKLH感作樹状細胞の腫瘍内投与の臨床試験を実施した。その結果、肺癌と悪性黒色腫において、全身性の免疫誘導効果、腫瘍マーカーの低下を伴うPRやSD例が認められた。今後、新たな外部資金を得て、症例の選択、腫瘍抗原の追加免疫、免疫抑制環境解除法の併用などの改良プロトコールでの臨床試験を計画している。

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